產(chǎn)品名稱:Caspase-1活性測(cè)定試劑盒
產(chǎn)品型號(hào):BC3810
產(chǎn)品特點(diǎn):Caspase-1活性測(cè)定試劑盒Caspase是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族,包含10多個(gè)成員。其中Caspase-1是唯1可剪切IL-1b和IL-18前體產(chǎn)生活性細(xì)胞因子的caspase。Caspase-11剪切45kD的caspase-1前體蛋白產(chǎn)生20kD和10kD片斷,這兩個(gè)片斷可以形成異源二聚體,并進(jìn)一步形成四聚體。
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Caspase-1活性測(cè)定試劑盒
產(chǎn)品介紹:
Caspase是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族,包含10多個(gè)成員。其中Caspase-1是唯1可剪切IL-1b和IL-18前體產(chǎn)生活性細(xì)胞因子的caspase。Caspase-11剪切45kD的caspase-1前體蛋白產(chǎn)生20kD和10kD片斷,這兩個(gè)片斷可以形成異源二聚體,并進(jìn)一步形成四聚體。此四聚體具有蛋白酶活性。Caspase-1通過剪切Bcl-XL調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,并通過對(duì)細(xì)胞因子前體的剪切來調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)。基于Caspase-1特異水解多肽底物Tyr-Val-Ala-Asp-p-nitroanilide (YVAD-pNA),釋放的游離硝基胺pNA在405 nm有大吸光度。采用可見光光度比色法測(cè)定pNA而得到Caspase活性。適用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞Caspase-1活性。
所需儀器:
可見光分光光度計(jì)配100μl 比色杯,或酶標(biāo)儀。波長(zhǎng)405 nm,也可測(cè)OD400~450 nm 但靈敏度略降。
操作步驟:
一、組織細(xì)胞準(zhǔn)備:
Caspase活性測(cè)定值低,見原因是未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少,其次是觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí),并非劑量越大時(shí)間越長(zhǎng)Caspase活性就越高。可設(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2、4、8、16、24小時(shí),以檢測(cè)的觀察點(diǎn)。通常2×107細(xì)胞或2mg組織裂解于1ml可產(chǎn)生1~3mg/ml蛋白。初次測(cè)定時(shí),單個(gè)測(cè)定反應(yīng)可加~200μg蛋白物對(duì)應(yīng)于2×106細(xì)胞或2個(gè)孔的6孔板細(xì)胞。少,單個(gè)測(cè)定反應(yīng)需加20μg蛋白對(duì)應(yīng)于2×105個(gè)細(xì)胞或2個(gè)孔的12孔板細(xì)胞。勿用絲氨酸蛋白酶抑制劑如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。
1、
(1)細(xì)胞裂解:1000g 5分鐘收集細(xì)胞,吸盡上清。每2~10×106細(xì)胞加50~100μl裂解液震蕩裂解,冰浴10分鐘,再次震蕩。
(2) 組織裂解:3~10mg組織加100 μl裂解液放入小型玻璃勻漿器,上下勻漿30次。轉(zhuǎn)移勻漿液于離心管。
2、4 ºC 12,000g 10分鐘,取上清測(cè)定,或-70 ºC保存。
3、蛋白定量:用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。裂解液含還原劑不宜采用BCA法。應(yīng)使蛋白濃度達(dá)到1-3mg/ml,相當(dāng)于每10 μl待測(cè)樣品含10-30μg蛋白,否則應(yīng)增加細(xì)胞用量。
二、測(cè)定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線:
1. 用反應(yīng)緩沖液稀釋10mM pNA 標(biāo)準(zhǔn)品為200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。設(shè)置不加pNA的零管。
2. 每一濃度取100 μl 加入96 孔板或100μl 比色杯,測(cè)定405nm 吸光度OD 值。
3. 每一濃度標(biāo)準(zhǔn)管OD405 值為x 軸,對(duì)應(yīng)的pNA 濃度為y 軸,用Excel 制作pNA 濃度對(duì)OD405值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
三、樣品測(cè)定操作:
1. 按下表設(shè)置96孔板反應(yīng)體系。底物后加入以使各管反應(yīng)起始時(shí)間相同。設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照管。酶活力不足或過高,可增加或減少樣品。
2. 蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 ºC反應(yīng)2小時(shí),肉眼可見顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2,此時(shí)即可測(cè)定。顏色變化不明顯可延長(zhǎng)反應(yīng)或過夜,但酶活性較強(qiáng)時(shí),孵育時(shí)間過長(zhǎng)將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。
3. 樣品管OD405減去空白對(duì)照OD405,為樣品Caspase水解底物產(chǎn)生的pNA吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量,并以蛋白濃度校正之。
4. 測(cè)得的Caspase酶活性表示方法有兩種。(1) Caspase活性增加的百分比:100% ×實(shí)驗(yàn)處理組OD / 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組OD,簡(jiǎn)單而可靠。(2)樣品Caspase酶活力單位/mg protein,但計(jì)算較復(fù)雜,參見說明。
產(chǎn)品說明:
1. Caspase酶活力單位定義:參考Chemicon公司One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37 ºC under saturated substrate concentrations。即當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí),一個(gè)Caspase酶活力單位定義為37 ºC 1小時(shí)水解pNA底物,產(chǎn)生1nmol游離pNA。根據(jù)pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品OD值,可計(jì)算出Caspase酶活力單位。
2. 除了處理組外,可設(shè)置陽性凋亡誘導(dǎo)劑組,陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照可包括不具有凋亡誘導(dǎo)作用的試劑(如果能得到)處理組、溶劑對(duì)照組、或凋亡誘導(dǎo)零時(shí)間點(diǎn)。
參考文獻(xiàn):
1. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J. 326, 1-16 (1997).
2. Porter AG and Janicke RU. Emerging role of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differ. 6, 99-104(1999).
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相關(guān)文獻(xiàn):
《Downregulation of circular RNA hsa_circ_0001649 indicates poor prognosis for retinoblastoma and regulates cell proliferation and apoptosis via AKT/mTOR signaling pathway》 作者:Lichen Xing,Leiming Zhang,Yali Feng,Zhe Cui,Lin Ding 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:3.743 PMID:29864621
《Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo》 作者:Wei Liu, Yuhua Chen, Jiao Meng, Minfei Wu, Fangfang Bi, Cuicui Chang, Hua Li & Liangjun Zhang 期刊:Journal of Neuroinflammationvolume 影響因子:5.7 PMID:29458437
《Pyroptosis engagement and bladder urothelial cells derived exosomes recruit mast cells and induce barrier dysfunction of bladder urothelium after UPEC infection.》 作者:Zonglong Wu,* Yan Li,* Qinggang Liu, Yaxiao Liu, Lipeng Chen, Hongda Zhao 期刊:Am. J. Physiol., Cell Physiol. 影響因子:3.553 PMID:31241987
Caspase-1活性測(cè)定試劑盒
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