一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(FITC)說明書
貨號(hào)：CA1040
規(guī)格：25T/50T
保存：-20℃保存，F(xiàn)ITC-dUTP需避光保存。如果頻繁使用（一周內(nèi)），5×Reaction Buffer，F(xiàn)ITC-dUTP和抗熒光淬滅封片劑可2-8℃保存。
產(chǎn)品簡介：
一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測是一種高靈敏度又快速簡便的細(xì)胞凋亡檢測方法。對于經(jīng)過固定和洗滌的細(xì)胞或組織，只要經(jīng)過一步染色反應(yīng)，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測到凋亡細(xì)胞。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以觀察到180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，這就是TUNEL(TdT--mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細(xì)胞凋亡的原理。
本試劑盒有如下優(yōu)點(diǎn)。
(1)高靈敏度：可以在單細(xì)胞水平檢測到細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于凋亡早期就有DNA斷裂，可以檢測到早期的細(xì)胞凋亡。
(2)特異性：TUNEL檢測時(shí)通常更容易標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不容易標(biāo)記壞死細(xì)胞。
(3)快速：僅需約1-2個(gè)小時(shí)即可完成。
(4)方便：只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可觀察，不必使用二抗等進(jìn)行多步操作。
(5)應(yīng)用范圍廣：可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。 TUNEL法特異性檢測細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂，但不會(huì)檢測出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開，另一方面也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞。 極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒有DNA斷裂，此時(shí)不適用TUNEL法檢測。在個(gè)別類型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下，好同時(shí)檢測多個(gè)凋亡指標(biāo)。
產(chǎn)品內(nèi)容：
試劑名稱 包裝 包裝
TdT酶 25μl 50μl
FITC-dUTP 25μl 50μl
5×Reaction Buffer 400μl 2×400μl
抗熒光淬滅封片劑 2.5ml 5ml
說明書 1份 1份
注意事項(xiàng)：
用戶需自備用于洗滌細(xì)胞的PBS或HBSS，用于固定的4%多聚甲醛，同時(shí)需自備含0.1% Triton X-100的PBS。如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K，二甲苯。 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 操作步驟：
1. 對于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片：
a. PBS或HBSS洗滌一次。
b.如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。
c.用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。
d.用PBS或HBSS洗滌一次。
e.加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
f.轉(zhuǎn)步驟5。
2. 對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液：
a. 收集細(xì)胞(不超過2×106細(xì)胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。為防止細(xì)胞聚集成團(tuán)，宜在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)的同時(shí)進(jìn)行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，冰浴孵育2分鐘。
e. 轉(zhuǎn)步驟5。
3. 對于石蠟切片：
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的佳作用溫度和時(shí)間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。
4. 對于冷凍切片：
a. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。 5. 配制TUNEL檢測液： 參考下表配制適當(dāng)量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。陰性對照不加TdT酶，其余相同。
1個(gè)樣品 5個(gè)樣品 10個(gè)樣品
TdT酶 1μl 5μl 10μl
FITC-dUTP 1μl 5μl 10μl
5×Reaction Buffer 10μl 50μl 100μl
ddH2O 38μl 190μl 380μl
總體積 50μl 250μl 500μl
6. 對于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時(shí)需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發(fā)。或者置濕盒中。
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。
7. 對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育30-60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時(shí)可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。
常見問題：
1. 出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記。
a. 有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
b. 使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海缫恍┧嵝怨潭ㄒ海瑢?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測反應(yīng)時(shí)間過長，或TUNEL檢測反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TUNEL檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
2. 熒光背景很高。
a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。 b. 高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)。可以用雙蒸水稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)時(shí)使用。
d. 紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此時(shí)宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。
3. 標(biāo)記效率低。
a. 使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
b. 固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。
c. 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅，解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時(shí)，如果碘化丙啶染色過深會(huì)導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5微克/毫升碘化丙啶。
相關(guān)產(chǎn)品：
P1020 1×PBS，PH7.2-7.4，0.01M
P1031 1×PBST，PH7.2-7.4，0.01M
T1300 胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25%)不含酚紅
T1350 胰蛋白酶消化液(0.25%)不含酚紅
12100 DMEM(H)
31800 RPMI Medium 1640
P1110 4％多聚甲醛
S2100 抗熒光衰減封片劑
P1120 10mg/ml蛋白酶K
CA1020 ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒
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